T Cell 體外放大培養-無血清培養基之選擇及應用

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九月 16, 2018 11501

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大部分的免疫細胞治療在生產過程中，都必須經過體外細胞擴增的步驟，這也是很重要且關鍵的一個部分，細胞必須能夠穩定、有效且安全的方式在體外環境擴增，其中很重要的輔助性材料之一就是培養基。

2017/08，Kymriah成為第一個獲得美國食品和藥物管理局批准的CAR-T免疫細胞療法。包含CAR-T，大部分的免疫細胞治療在生產過程中，都必須經過體外細胞擴增的步驟，這也是很重要且關鍵的一個部分，細胞必須能夠穩定、有效且安全的方式在體外環境擴增，其中很重要的輔助性材料之一就是培養基，過去在實驗室中培養T細胞主要會使用到有動物性來源的胎牛血清(FBS)或人血清，但目前FBS的使用在臨床上被認定是有較高的風險，因為FBS的成份非常複雜且屬於異種來源，未來若要將該細胞製劑打入人體，可能需擔心成分殘留的問題、殘留的成分可能造成複雜的免疫反應以及其可能使病患暴露潛在新型感染性病原體。

相較於動物血清，使用人血清(Human serum)相對較安全，但人血清價格高，生產流程也需要對來源進行許多檢測，包括一些藥物測試及傳染性微生物，而且可能會有一些新興傳染因子出現，這部分是無法事先檢測到的，另外，除了產品批次之間的差異之外，供應量也還是一個問題，若未來T細胞免疫療法通過數量增加，將導致人血清的需求可能會供不應求。因此，若要將T細胞免疫療法能夠大規模的商業化，不依賴人血清的使用將會是重要的發展方向，也因此已有許多廠商開始推出許多無血清培養基，這些無血清培養基的主要訴求是更安全、使用更方便、效果穩定一致且無批次間差異。

根據報告(Zion Market Research)， 2017年全球細胞培養基市場價值約為6.76億美元，預計到2026年將達到約13.94億美元。預計全球細胞培養基市場的複合年增長率將超過2018年至2026年間為8.2％。

第一個無血清培養基（SFM）是在1965年開發的，從那時起，幾種改良的培養基被引進市場。最常用的T細胞擴增培養基是使用含有10％胎牛血清的RPMI 1640。在1970年末，為了移除對胎牛血清的依賴，Iscove改良了Dulbecco氏培養基，稱為IMDM，它在DMEM培養基中增加一些關鍵成分，例如人轉鐵蛋白，複合脂質，以及與補充的緩衝能力HEPES。將DMEM和F-12培養基以1：1體積混合而產生的DMEM：F12則能夠在沒有血清的情況下支持細胞的擴增。在20世紀80年代末和90年代初期，用於T細胞擴增的專有細胞培養基的開發則主要是基於對IMDM和DMEM：F12的改良。

對DMEM：F12的改良而產生了 AIM-V (Gibco)，而對IMDM的修飾則開發出了X-VIVO (Lonza) 系列的培養基。而目前對於用於過繼性T細胞治療的最佳培養基是哪一種，市場上並沒有達成共識; 然而，目前許多單位主要使用的T細胞培養基為RPMI 1640、 AIM V或X-VIVO 15 ，其中AIM V和X-VIVO 15被定義為無血清培養基(SFM)，但真正在T細胞的生產過程中普遍都是需要再添加人血清，通常會使用Human AB serum，或病患自己的auto-plasma，主要是因為病患者來源的T細胞無法在完全無血清培養基中生長，而這也是目前還需要突破的部分，也因此有許多新的廠商投入開發新的T細胞培養基，針對各種不同類型的T細胞做成分的調整及優化，就是希望能再不依賴使用人血清的狀況下培養出可以用於治療用的T細胞。

迄今為止，所有過繼性T細胞治療試驗均有使用人血清，然而，隨著美國食品和藥物管理局（FDA）批准的更多療法後，人類血清極有可能變得短缺，除非採取根本措施來增加人血清的供應，否則對過繼性T細胞治療來說會是一個很大的限制。

下表整理出目前一些T細胞無血清培養基產品(將持續更新)，而是可能比較可以應用再T細胞臨床應用的產品，當然，就如同前面所提到的，目前並沒有共識指出哪一個培養基是最好的，也因此在選擇的策略上大改有幾點可以注意，當然最重要還是直接對產品進行其效能驗證，畢竟每一種過繼性T細胞療法所需要的T細胞類型有所不同。

選擇無血清培養基

先不論品牌名氣，從臨床應用的需求規格來看，cGMP製造的法規遵循是首要的，若能有FDA DMF登記則相對在安全性上更有所憑據，再來就是培養基的成分，而內容物成分都是各品牌的商業機密，但最好能選用serum-free及xeno-free的配方，xeno-free比serum-free有更高的安全性，當然比xeno-free更高一等且配方更能被明確定義的則是chemically defined或animal-component-free，但通常相對的價格會較高。在使用方式必須再特別注意各品牌培養基的使用說明，目前大部分的T cell培養基並非ready-to-use，必需額外再添加一些細胞生長因子，例如IL-2。此外，有一些則有提到可能必須額外添加部分的人血清，但若要用人血清的話，則問題就如前面所敘述的狀況一樣，未來可能會有取得不易的問題。

從品牌和產品來看，目前X-VIVO和AIM-V為兩個較多單位使用的產品，都是大廠商生產的產品，因為較早推出，市場占有率也較高，不少臨床試驗也是用這兩款培養基，這也是這兩個產品的優勢。另外，日本也是很早就投入免疫細胞療法的研發，而日商KOHJIM BIO所推出的KBM系列免疫細胞無血清培養基也算有名氣，亞洲許多國家也都有在使用，此外，TaKaRa及CORNING所推出的免疫細胞培養基也都是出自和KOHJIM BIO的合作，目前CORNING和TaKaRa在中國也都有設廠生產相關培養基，KOHJIM BIO藉由合資或技術授權的方式擴大市佔率，也就是說，這三個品牌推出的產品，其內容物成分可能應該都是一樣的，基本上可以視為同等品，主要為產地上或品管上的差異。

另外，值得注意的Irvine Scientific及INVITRIA，這兩間位在美國的公司則推出chemically defined & animal-component-free的 T細胞培養基，其中PRIME-XV® T Cell Expansion CDM則是第一個推出完全化學定義且無動物成分配方的T細胞培養基，且使用時不需要再額外添加人血清，這樣一來可最大限度地降低外來因子帶來的潛在風險。包含CAR-T及其他過繼性T細胞療法在技術上不斷在進步，但若未來要能夠將其商品化且大規模的應用到臨床治療，這些無血清培養基的開發也是非常重要的一環。

產品比較表如下

	Product Name	Cat.No	Size	Cell Type	Serum-free	Xeno-free	ACF, CDM	Phenol Red	Antibiotics	GMP	DMF (Drug Master File)
Biological Industries	BIOTARGET™ SFM	05-080-1	500 ml	PBMC - peripheral blood mononuclear cells (lymphocytes and monocytes)	v	v		v	x	Manufactured in ISO 13485:2016 and ISO 9001:2008 certified facility
Corning	KBM 581 Serum-free Cell Medium	88-581-CM	1000 ml	CIK	v			v	v	GMP	DMF
Corning	KBM 551 Serum-free Cell Medium	88-551-CM	1000 ml	T lymphocytes	v	v		v	v	GMP	DMF
CellGenix	GMP Stem Cell Growth Medium (SCGM)	20802-0500	500 ml	Hematopoietic stem cells (HSC) Cytokine induced killer cells (CIK cells) Natural killer cells (NK cells)	v	v		x	unkonw	USP Chapter	FDA DMF available
Gibco (Thermo)	CTS™ AIM V™ SFM	0870112DK	1000 ml	Dendritic Cells, Fibroblasts, Hybridomas, Lymphocytes, Macrophages, Monocytes, Myeloma Cells, PBMCs, T Cells	v			v	v	manufactured in compliance with cGMP	DMF is filed with the FDA
Gibco (Thermo)	OpTmizer™ CTS™ T-Cell Expansion SFM	A1048501 (basal medium + supplement)	1000 ml	T cells	v	v		v	x	cGMP Class II Medical Device	DMF is filed with the FDA.
Irvine Scientific	PRIME-XV® T Cell Expansion CDM	91154-1L	1000 ml	CD3+ T lymphocytes derived from human PBMC	v	v	v	x	x	Manufactured in compliance with cGMP regulations	DMF fled with the US FDA
Irvine Scientific	PRIME-XV® T Cell Expansion XSFM	91141-1L	1000 ml	T lymphocytes	v	v		v	v	Manufactured in compliance with cGMP regulations	DMF fled with the US FDA
INVITRIA	OptiPEAK T Lymphocyte	777OPT069	500 ML	T lymphocytes	v	v	v	v		ISO9001 cGMP	No
KOHJIM BIO	KBM551	16025510	1000 ml	T lymphocytes	v	v		v	v	ISO13485	No
Lonza	X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	04-418Q	1000 ml	monocytes, macrophage cells and cell lines, PBL, granulocytes, and natural killer (NK) cells	v	v		v	v	manufactured under cGMPs	listed with the FDA in a Product Master File
Lonza	X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	04-744Q	1000 ml	monocytes, macrophage cells and cell lines, PBL, granulocytes, and natural killer (NK) cells	v	v		x	x	manufactured under cGMPs	listed with the FDA in a Product Master File
Miltenyi Biotec	TexMACS™ GMP Medium	170-076-309	1000 ml	human T cells and Treg cells	v	v		x	unkonw	ISO13485 USP	No
TaKaRa	GT-T551 medium	WK551S	1000 ml	T lymphocytes	v	v		v	v	unkonw	No
STEMCELL Technologies	ImmunoCult™-XF T Cell Expansion Medium	10981	500 ml	T lymphocytes	v	v		v	unkonw	USP	No