在過去的幾十年中，間質幹細胞（MSCs）在再生醫學和細胞療法中備受關注，讓許多退化性疾病有機會發展新的治療策略，它們可以很容易地進行培養擴增、來源取得沒有道德上的隱憂、具有自我複製的能力並且可分化成許多不同的細胞，研究中也顯示出MSC有多種免疫調節特性。目前被研究且應用較多的MSC來源主要來自骨髓、脂肪、臍帶和臍帶血。

以臨床應用目地來看，這些由組織分離出來的MSC還需要在體外放大到一定的細胞數量才能有被臨床應用的價值，所以如何在體外大量的培養符合GMP規範的MSC成為製程上關鍵的重要技術，而其中培養基(medium)的使用則是扮演關鍵角色。

迄今為止，胎牛血清（FBS或者稱為FCS）是用於真核細胞體外培養的最廣泛使用的血清補充劑，FBS中含有豐富的生長因子和激素可刺激細胞增殖，其能夠支持多種細胞類型的生長，據估計，全球每年生產量大約為50萬公升。而胎牛血清的使用通常被認為是MSC培養的標準，從研究論文中可以看到一般多數用來培養hMSC的培養基為含有10%胎牛血清(FBS)的AMEM或DMEM (Dolbecco’s Modified Eagle’s Medium supplemented with 10% FBS)，目前有許多MSC的細胞治療應用的臨床試驗正在進行，而且是使用胎牛血清作為添加劑。然而，胎牛血清批次之間存在很大差異，且可能涉及傳播來自牛的異種病原菌感染或引發異種免疫反應的風險，也因此人們對基於FBS的培養基的安全性提出了擔憂，因此應用在臨床細胞治療則會有較高的風險，因此根據GMP的規範，用於臨床治療目的的細胞培養應避免使用動物血清，而較理想的培養基其中內容物成分最好不要含有任何異種動物性來源的衍生物。

 使用胎牛血清的缺點

1. 許多FBS化合物尚未被鑑定，並且對於許多鑑定的物質，培養細胞的功能仍不清
2. FBS顯著的批次差異，這使得每個批次的預測試成為必要。
3. FBS的高內毒素含量也引起適用性和安全性的問題
4. FBS可能引發針對異種血清抗原的免疫反應
5. FBS也是微生物污染物的潛在來源，如真菌，細菌，病毒或黴漿菌。據估計，20-50％的市售FBS受到病毒污染，特別是牛病毒性腹瀉病毒。

2005年Doucet 等人[ J Cell Physiol 2005;205:228-36, Platelet lysates promote mesenehymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy application ]發表使用人類血小板裂解濃縮液(human Platelet Lysate, hPL)可以用來培養hMSC，hPL已被證明是一種非常有效的細胞培養添加劑，可同時用於許多實驗室和臨床試驗，後續更多研究也發現無論是使用自體或是異體的hPL都可以用來培養hMSC，這些研究逐漸開啟了hPL新的應用領域，其內容物中富含生長因子和細胞因子，不僅可以支持由骨髓、臍帶血、臍帶和脂肪中等多種組織中所分離出來的MSCs的擴增，也可以支持包含human endothelial cells、human fibroblasts的生長。此外，hPL的生產流程也可以遵循GMP的規範，並用於MSC的細胞放大及臨床的應用。

研究發現在功能上hPL可以取代FBS，且所需的用量也較FBS少，細胞生長的狀況甚至較使用胎牛血清要好，也就是說HPL不僅可以完全取代FBS，也能提供一個無異種來源(Xeno-free)的細胞培養條件，這對臨床的應用是重要的。

圖示FBS 和 hPL的生產流

   圖片資料: Cytotherapy, 2014; 16: 170-180

了解hPL的優缺點及成分

目前也有許多hMSC的細胞治療臨床試驗也是使用hPL，這也表示各國的法規單位對hPL使用在細胞治療方面是認可的，雖然如此，使用HPL仍然有一些無法避免的風險，hPL具有幾個優點和缺點，1. 許多研究證明hPL在支持MSC細胞培養擴增部分其效能比FBS、PRP(Platelet-rich plasma)來的更好，尤其是脂肪組織來源的MSC，其增殖效果明顯提升。2. hPL在目前的臨床治療應用中並且沒有觀察到嚴重的副作用。使用hPL培養的MSCs，仍可保留其免疫抑制的特性。3. 由於hPL來自於人，不須擔心來自牛的病毒或對牛來源的外來蛋白抗原產生免疫反應。4. hPL可以也自患者的血液中濃縮分離來使用，沒有免疫問題或人類疾病感染的風險。

儘管有上述優點，但hPL也有一些局限性，hPL和FBS相同的一點就是其內容物實際上含有那些成分及濃度是無法列及定義的，另外，雖然使用hPL比使用FBS更不會發生免疫反應，但仍是有可能發生，特別是在同種異體環境中。此外，hPL還是可能傳播人類疾病，例如HIV、B型肝炎和C型肝炎或梅毒..等，盡管所有血液產品都必須接受這些疾病的檢測，但這並無法完全排除感染的風險。

因此建議使用單位必需選擇較值得信賴的供應商，並特別注意製造商的品管及血小板取得的合法性，並了解該供應商是否能提供完整的產品出廠驗證及來源等資料，最好能再購買前和供應商索取CoA或CoO資料，並確認該產品製造商是否是遵循cGMP規範進行生產。

hPL的成分是什麼

活化的血小板可以提供組織修復，例如EGF、BFGF、IGF-1、PDGF、TGF-beta及VEGF…等，在無FBS及任何外源性的生長因子之下，hPL中所含的這些生長因子也顯示出可以提升MSC的增殖率並維持其分化的能力。此外其生長因子也能支持MSC分化成硬骨細胞，包含BMP2、BMP4、BMP6、IL-1、osteonectin、PD-EGF、IGF-1、PDGF、TGF-beta及platelet factor 4等，其中部分生長因子已被證實能誘導MSC分化成硬骨細胞。 

另外，血小板富含凝血因子，故其主要功能之一為幫助凝血，而血小板裂解液雖然經過純化，但仍較難完全移除凝血因子，因此在使用hPL當作細胞培養添加劑的同時，通常必須額外添加一些抗凝血劑以避免培養基中發生凝血反應，進而使培養基發生凝膠化的情形。在使用hPL作為添加劑時必需額外添加heparin(肝素)以避免抗凝血的作用發生，但必須注意heparin的使用濃度，若濃度太高可能會影響MSCs細胞的生長，在細胞治療臨床應用時必須特別注意。另外，法規單位可能會詢問最終產品是否有heparin的殘留，這是使用hPL存在的問題。

但若不想在培養基中額外添加heparin，則必須選擇heparin-free的hPL，目前市面上已經開始也有一些這類型的產品可供選用，主要是在製程上升級，去除掉更多可能產生凝血反應的成分，使用heparin-free的hPL在細胞治療的臨床應用上會更加適合及便利。選擇hPL的供應商也是非常關鍵及重要的，若打算使用HPL來當作固定的細胞培養添加劑，則必須特別注意，必須對 使用hPL優點和缺點有一定的了解，因為細胞培養添加劑的選擇對細胞製劑具有重要影響。

從FBS培養基換成使用hPL當作添加劑是否可行?

筆者認為這個問題的答案是肯定的，從前文可以了解到使用hPL在細胞培養的效果上應該是會比使用FBS來的更好，且風險更小，尤其使用在MSCs的細胞培養上，已有許多研究的支持。而以細胞治療臨床應用來看，使用hPL將比FBS更加適合，目前各國的衛生醫藥法規單位對於使用FBS的風險有較高的疑慮。所以建議臨床應用的製程可以使用hPL或Xeno-free defined medium當作培養基。

但若要從FBS轉換到hPL，還是建議需要進行嚴謹的測試，畢竟在成份上仍有一定的差異，最重要的還是必需要確認不同的成分是否會影像細胞臨床治療的療效。當然除了觀察細胞的生長的狀況(生長速度、外觀..等)之外，文獻中也有比較MSC的DNA其甲基化的程度在使用FBS和hPL之間是否有差異，結果發現兩者之間並無顯著差異。

選擇hPL有幾個部分值得注意，提供各位參考

1. 生產製造是否符合GMP規範
2. 是否取得DMF (Drug Master File)，安全性上更有保證
3. 完整的CoA及CoO資料，確保批次生產的品質及血源來源的安全性及合法性
4. 是否已有臨床試驗正在使用此產品
5. 製程中若有使用到heparin，是否會對後續實驗造成影響

參考資料:  Cytotherapy, 2017;19:155-169,  Cytotherapy, 2014; 16: 170-180