生物製藥及細胞治療產品之黴漿菌(Mycoplasma)汙染管控及檢測

黴漿菌的汙染一直是細胞培養過程中必須面對的問題，一旦細胞被黴漿菌感染，細胞的生理層面將會有很大的改變。對於用於醫療目的之細胞衍生的生物製藥或是細胞治療等產品，若發生細菌污染將會對患者會構成潛在的安全風險，並且會對製造商帶來嚴重財務損失的風險，而為了將這些風險降到最低，在整個產品製造和開發過程中進行黴漿菌的定期檢測是必要的。

深入了解黴漿菌

黴漿菌(Mycoplasma)是一類無細胞壁結構、介於獨立生活和細胞內寄生之間的最小的原核微生物，目前已知有超過190種分佈於人類、動物、昆蟲和植物，其大小及外形多變，部分黴漿菌對動物會有致病性，且黴漿菌常寄生在人體表面，可以說黴漿菌非常普遍的存在生活環境中。

黴漿菌是細胞實驗中很常見的汙染源，非常容易造成以細胞或組織培養方式所生產之產品，估計研究中使用的細胞培養物中約有15%~35％是受到黴漿菌的感染，且在不同實驗室中預估有10％到85％的細胞可能受到其污染，而主要的黴漿菌汙染源是來是實驗室操作人員。然而黴漿菌體積極小，一般介於0.15~0.3 μm，因此用透過肉眼做顯微鏡檢測，體積小也使得黴漿菌能夠逃離許多過濾系統，其無法用一般培養基用的0.22 μm 過濾膜移除，可能至少必需使用0.1 μm的濾膜才有可能將其移除，另外，黴漿菌可在細胞培養中生長至高濃度且不會導致培養基混濁，因此黴漿菌的汙染經常被忽略。此外，黴漿菌的基因組非小，因此大大降低了它們的生物合成能力，導致它們嚴重依賴外源性膽固醇、氨基酸、脂肪酸、維生素和宿主環境中提供的代謝物，也因如此，黴漿菌將會造成細胞許多損害，包括染色體異常、破壞核酸合成、影響細胞代謝、改變細胞膜特性、誘發細胞程式性凋亡等。

細胞株目前已被廣泛地用於生產許多治療或醫學用途的生物產品，包括細胞因子、病毒疫苗、單株抗體和生長因子。對於生物製藥的生產，黴漿菌的污染可導致細胞產量減少並可能影響產品的質量。此外，如果黴漿菌污染物存在於最終的生物製品中，它可能會直接影響病患的安全。在財物的損失上，受到黴漿菌污染的該批次產品必須銷毀，此外，還需要花費許多時間及費用去調查汙染源，並再次進行設備的清潔，這可能導致數月的寶貴生產時間損失以及數十萬美元的相關費用。

近年來，隨著細胞治療的應用興起，黴漿菌的檢驗也變成了必要的項目，用於治療用途的細胞產品本身則更不能有黴漿菌的汙染發生，因為這不僅將導致細胞本體的品質受到很大的影響，且更可能會引發細菌感染，因此為了確保細胞製品及其生產過程不受黴漿菌的汙染，進行檢驗則是非常必要之品管過程。

台灣TFDA在其所頒布的”人類細胞治療產品查驗登記審查基準”中也提到在細胞產品的特性分析中必需做微生物測試，其中就包含了黴漿菌的檢測，主要就是要確保產品與製造過程中所使用的原物料沒有遭受黴漿菌的汙染，至於檢測方式則可以參考TFDA所公告之「生物藥品檢驗基準 III」或中華藥典。

黴漿菌的檢測

針對黴漿菌的檢測方法及細節，在生物藥品檢驗基準中已有詳細的介紹，主要的偵測方法共分成三種，分別是培養基培養法(culture)、指示細胞培養法(Indicator, Hoechst DNA stain)及聚合酶鏈鎖反應測試法(PCR NTA-base)，其中直接培養基培養法的形式進行檢測是相對較耗時費力，最多需要28天才能完成，此方法的使用在時間上會有較大的限制，某些產品的半衰期可能較短，無法等這麼久，尤其是活細胞，此外，培養測定的靈敏度可能會受到一些其他因素的影響；例如，培養基成分的品質、培養基製備的穩定性、黴槳菌培養的操作或黴漿菌標準品的缺乏。

而檢驗黴漿菌污染的另一個替代方法是使用聚合酶鏈鎖反應(PCR)，從法規的可行性來看，PCR的檢測方法在經過適當的確效評估後是可以替代前面兩種檢測方法，且PCR也已經被證明是一種快速可靠的替代方法，此方法也非常適合在實驗室操作，此外，PCR具有高敏感性、特異性、可靠性、速度快且其檢測成本相對較低，但主要缺點是無法區分活的黴漿菌和死的黴漿菌。但PCR的實驗條件也需要做一些測試，並搭配適合的positive, negative及internal control一起進行，以避免可能出現的偽陽性或偽陰性。目前，許多基於PCR的方法都是以黴槳菌基因組16S rRNA區域當作擴增的目標，為了確保該方法的特異性，在PCR的引子的設計就必須要特別注意其特異性，必須盡可能防止黴槳菌以外的細菌被偵測到。

PCR的檢測方式對於細胞治療的應用也顯得更加重要，因為PCR能夠快速地進行實驗及分析結果，適合用於替代直接培養法及指示細胞培養法，因為在某些細胞治療的應用是必需使用非凍存過的細胞，也就是細胞在體外培養後不再經過冷凍保存的步驟，需在短時間內要直接施打到病患體內，有時效性的問題，那麼使用PCR的檢測方式是非常合適的方法；但若可使用解凍後的細胞進行施打，相對時間上彈性較高，則不一定要選用PCR的方式來檢測，而可以選擇在細胞凍存之前使用直接培養法做檢測。

而目前市面上有許多已經商品化的PCR kit可以選購，因此這也是目前較常被使用的檢測方法，但若選擇使用PCR方法，則依照TFDA的規範，是必需要去對其敏感度、專一性及耐變性去進行確效，另外，中華藥典(7009)也有針對黴漿菌的檢測方法有詳細的說明，其中「7009.1 以核酸擴增技術檢測黴漿菌之分析方法確效指引」中也清楚說明如何針對市售的PCR套組進行產品的確效。而PCR方法的確效主要需要注意幾點，若要取代培養基培養法，則其對黴漿菌應能檢出達10CFU/mL，而若要取代指示細胞培養法則敏感度應能檢出達100 CFU/ml；另外，在實驗的對照組部分則可以設計包含有internal control、positive control和negative control，其中使用internal control是可以確保待測檢體本身並不含有抑制PCR反應的物質，避免實驗出現偽陰性的狀況。

目前已有許多以PCR方法所開發的檢測套組，可分為一般傳統PCR及qPCR(即時定量PCR)，後者售價通常較高，且需添購qPCR專用設備。另外，在待測樣品的種類大致又可分為兩種，直接取細胞培養基(cell culture supernatant)即可進行PCR，另一種則是需要透過核酸純化萃取的方式進行。一般若有發生黴漿菌汙染，通常在細胞培養基中也會有殘留很高量的黴漿菌，所以有些Kit式標榜不需要做核酸純化的步驟，相對步驟操作簡單。

而前面也有提到PCR方法檢測的靈敏度需達10CFU/ml，而在選購檢測套組時最好詢問廠商是否能提供靈敏度確效的驗證報告，細胞治療產品相關審查單位也會對所使用的檢測套組期效能做審查。當然，最好的做法是使用單位自行建立對所使用的檢測套組靈敏度確效的方法，市面上目前也可以購買到10CFU/ml的特定黴漿菌株標準品(Standard)來進行內部產品的靈敏度確效試驗。

總而言之，黴漿菌的污染及防治是生物製藥細胞治療生產商及的一個重要問題，因為它代表了潛在的安全性隱憂及和可能造成的財物損失，通過適當的檢測方法對整個製造過程中的污染進行常規測試可以幫助降低這些風險的發生。而使用PCR的方式進行檢測在時間上的彈性較高，且PCR已經是非常成熟的技術，目前也有許多商品化的檢測套組，使用PCR的檢測方式其實非常適合用於生物製藥或是細胞治療產品生產的應用，速度快且敏感度高，但使用前則必需做好產品的確效性測試。

目前在台灣黴漿菌的委外檢驗單位如下:

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